No Laboratório de Regulação da Expressão Génica em Plantas, no ITQB NOVA, o investigador Nélson Saibo e a sua equipa estão a utilizar a ferramenta de edição genética CRISPR-Cas9 para desenvolver investigação inovadora em arroz e tabaco. No caso do arroz, o objetivo é melhorar a sua resistência a condições ambientais adversas como secura, salinidade e temperaturas extremas – situações cada vez mais frequentes devido às alterações climáticas. No caso do tabaco, estão a criar ferramentas para estudar variantes da enzima Rubisco provenientes de outras plantas para melhorar a eficiência fotossintética e a tolerância à secura e a temperaturas extremas.
Entrevista: Margarida Paredes / CiB
Fotografia e vídeo: Orlando Almeida
Trabalha com arroz e utiliza a tecnologia CRISPR-Cas9. Que objetivos pretende atingir com a aplicação desta ferramenta nas plantas de arroz?
No caso do arroz, neste momento há dois projetos europeus principais (mais ativos) nos quais estamos envolvidos. Um é um projeto colaborativo, chamado Photoboost (https://www.photoboost.org/) que termina no fim deste ano e visa aumentar a eficiência fotossintética do arroz através da transformação com diferentes genes envolvidos na fotossíntese (transformação convencional). O outro chama-se CRISPIT (https://www.fc.up.pt/crispit/), é um projeto Marie Curie Staff Exchange coordenado pela Universidade do Porto. Neste caso, o objetivo é, utilizando a tecnologia CRISPR, criar variedades de arroz mais tolerantes às temperaturas elevadas na altura da floração. Estamos também a trabalhar num projeto em foto-biologia, que tem como objetivo estudar o efeito da luz no desenvolvimento do arroz, nomeadamente nas fases iniciais da germinação e no tempo de floração. E outro projeto que envolve o estudo da regulação do metabolismo / fotossíntese C4, mais eficiente, com o objetivo final de implementar este metabolismo em plantas C3, como o arroz.
O objetivo final é sempre a melhoria da produtividade?
Sim, o objetivo é sempre esse, quer seja em condições ambientais ótimas, quer seja em condições adversas (de stress). Esse é sempre o objetivo do nosso trabalho, queremos obter conhecimento que mais tarde possa ser utilizado para melhorar a cultura do arroz, para melhorar a sua produtividade em diferentes aspetos. Não só como resposta a situações de stress – em Portugal temos o problema das temperaturas extremas, da salinidade e da falta de água – , mas também em condições ótimas. Por exemplo, um dos problemas que tempos em Portugal está relacionado com a altura em que o arroz vai florir. Um dos estudos que temos é nesse sentido. Fizemos uma publicação há dois anos na qual caraterizámos o mecanismo em arroz que regula o tempo de floração. Portanto, sabendo qual é o mecanismo de regulação da floração, nós conseguimos depois ajustar, nas diferentes variedades, o tempo de floração (mais tardio ou mais precoce, dependendo do que é mais favorável para os produtores).
Que desafios específicos enfrenta ao tentar melhorar a resistência das plantas de arroz às alterações climáticas?
O principal desafio é conseguir fazer refletir nos ensaios de campo os resultados que temos no laboratório, mas não é fácil, pois é difícil mimetizar em estufa ou câmara de crescimento as condições de campo. O que temos que mudar não é aquilo que fazemos no campo mas sim o que fazemos no laboratório, eventualmente tentar o mais possível reproduzir no laboratório as condições a que as plantas estão expostas no campo. Enquanto no laboratório o ambiente em que as plantas se desenvolvem é controlado (isto é, dificilmente combinamos os stresses – ou estudamos a salinidade, ou estudamos a resposta da planta ao frio, ou a resposta ao calor, ou a resposta à secura), no campo as plantas estão expostas a vários stresses abióticos e bióticos ao mesmo tempo. Isso faz com que, muitas vezes, os resultados que temos em laboratório não são observados no campo. Para começar, precisamos de estudar em laboratório a resposta das plantas a vários stresses ao mesmo tempo. Neste momento, esse é o principal desafio para mim.
Também trabalha com a planta de tabaco para estudar a enzima Rubisco. O objetivo é desenvolver tolerância à secura e elevada temperatura em plantas cultivadas. De que forma é que isto acontece?
Em tabaco temos dois trabalhos que estão a decorrer em paralelo, os dois em colaboração com o Max Planck Institute. Num identificámos três aminoácidos na rubisco que poderiam estar relacionados com uma resposta mais adequada ou menos adequada da planta a condições adversas, neste caso de secura e de temperatura elevada. Portanto, identificámos esses aminoácidos e fizemos modificações nos mesmos para estudar até que ponto é que as plantas, com aquelas modificações, se tornavam mais ou menos tolerantes aos stresses ambientais. Nós estamos a fazer isto em tabaco por causa da facilidade que há em fazer trasformação nesta planta. Aliás, já temos alguns resultados interessantes que poderão ser traduzidos para outras plantas com mais interesse económico, nomeadamente cereais como o arroz, trigo e milho.
Outro trabalho, com o tabaco também, consistiu em produzir uma ferramenta que permita a outros investigadores estudar a rubisco. O que se sabe é que rubiscos de diferentes espécies tem diferentes características e o que se faz muitas vezes é introduzir, por exemplo, uma rubisco de girassol (que tem algumas características interessantes em termos de eficiência fotossintética) numa planta de tabaco para ver se isso traz alguma vantagem para a planta. Mas aí o que vamos ter é uma mistura – a rubisco de tabaco com a de girassol. O que quisemos fazer, e já conseguimos, foi eliminar a rubisco de tabaco para conseguir introduzir uma de girassol ou de outra planta para a estudar, tendo apenas aquela e não uma mistura. Portanto, o que fizemos basicamente foi, através da tecnologia CRISPR, eliminar a rubisco no tabaco. Ficamos então com uma planta que não faz fotossíntese, quase não tem clorofilas, é completamente branca e só cresce se lhe fornecermos açucar (o açucar que era suposto ela produzir através da fotossíntese se tivesse a rubisco).
Estuda o arroz e o tabaco porquê? Pela sua importância económica?
No caso do arroz essa foi a razão principal, sim. Trata-se de uma planta com um grande interesse económico a nível nacional (Portugal é o país da Europa que consome mais arroz per capita – 17 kg por pessoa por ano) e mundial (é a base alimentar de dois terços da população mundial, sobretudo da população mais pobre). Outro dos motivos que, inicialmente, me levou a estudar o arroz é porque havia alguns problemas na cultura do arroz, nomeadamente o frio e a elevada salinidade. Em Portugal é cultivado entre os meses de maio e setembro, mas mais a norte as noites permanecem frias no inicio do ciclo de vida do arroz e isso afeta o seu desenvolvimento e produtividade. O arroz é uma planta muito sensível ao frio. Em Portugal o arroz é muito cultivado nas bacias dos rios, fazendo com que possam existir problemas de elevada salinidade.
Que critérios utilizam para selecionar os genes a editar com a tecnologia CRISPR-Cas9?
Depende daquilo que estamos a fazer. Acho que posso agrupar em dois grandes critérios. Um deles é quando queremos fazer o estudo funcional de um gene. Para isso temos de inativar ou fazer o chamado knockout do gene para percebermos de que modo ele faz falta na planta. Outro critério é, dependendo da sua função, tentamos identificar um gene cuja eliminação pode ser benéfica para a planta. Estes são fundamentalmente os critérios que usamos para selecionar genes que vamos editar com CRISPR. Em Portugal, pelo menos na área das plantas, esta tecnologia tem sido maioritariamente utilizada para eliminar genes, porque é o que é mais fácil; tem sido pouco utilizada para fazer edição fina (alterar um nucleótido que leva à alteração de um aminoácido), porque isso inicialmente exigia que houvesse recombinação homóloga – a recombinação homóloga em plantas é possível, mas tem uma eficiência muito baixa. Hoje em dia obtemos essa eficiência com a tecnologia Prime editing, que é ligeiramente diferente, permite-nos fazer a tal alteração fina dos genes (o Prime editing faz parte do CRISPR, exige na mesma ter uma nuclease).
Por que razão optou pela tecnologia CRISPR-Cas9 e não por outras ferramentas de edição genética?
O CRISPR tem evoluído muito nos últimos anos. É muito eficiente e muito flexível. As pessoas ouvem falar mais no CRISPR-Cas9, mas existem muitas mais Cas, existem diferentes nucleases que nos dão uma flexibilidade muito maior porque têm características diferentes, têm algumas particularidades que nos permitem fazer coisas diferentes e com uma precisão diferente também.
Existem riscos associadas ao uso de CRISPR-Cas9 em plantas?
O único risco que consigo identificar é aquilo a que chamamos offtargets, ou seja, os alvos não específicos. O CRISPR funciona com um oligonucleotídeo, cuja sequência de DNA vai permitir identificar o sítio no genoma que queremos editar. Se essa sequência de DNA não for tão específica como gostaríamos, pode identificar essa sequência ou pode identificar outra, indo provocar uma edição noutro sítio no genoma. O que temos de fazer é tentar desenhar essa sequência de modo a ser o mais especifica possível (as ferramentas informáticas que existem hoje em dia permitem fazer isso e permitem prever que alvos não desejáveis poderão acontecer e em que percentagem; o que nós fazemos depois é analisar esses alvos para verificar se também foama alterados). No meu laboratório já editámos mais de uma centena de genes e nunca identificámos edição em alvos não desejados. Diria que o risco é muito pequeno uma vez que, mesmo que aconteça, a tecnologia permite indentificar a edição indesejada.
Qual é o resultado mais interessante até agora da investigação que tem desenvolvido no arroz?
Talvez o resultado mais interessante, que só foi possível graças à utilização da tecnologia CRISPR, é termos conseguido perceber ao nível molecular, e em termos de vias de sinalização, de que modo é que o fotoperíodo regula o tempo de floração na planta do arroz.
Por que é que a forma como o fotoperíodo regula a floração do arroz é importante para aumentar a produtividade?
O fotoperíodo é o tempo de horas de luz. Sabemos que um dos problemas da plantação do arroz em Portugal está relacionado com os picos de calor que ocorrem nas últimas duas ou três semanas de agosto, altura em que o arroz está a florir e em que está a acontecer a fecundação. Se em vez de 90 dias conseguíssemos encurtar o tempo de floração para 60 ou 70 dias, poderíamos evitar o período de maior pico de calor. Isso permitiria aumentar a produtividade. O conhecimento destes mecanismos poderá também permitir cultivar em Portugal variedades de arroz que hoje em dia não conseguimos cultivar porque não estão adaptadas ao nosso fotoperíodo.
A União Europeia quer criar uma regulamentação específica para as Novas Técnicas Genómicas (NTG). Tem esperança que as suas descobertas possam ser aplicadas na agricultura em larga escala e no combate às mudanças climáticas ou teme que não passarão de experiências no laboratório?
Tenho muita esperança que dentro de pouco tempo surja uma regulamentação das NTG favorável à sua utilização no campo. Se não for durante a Presidência polaca [do Conselho da UE], espero que seja na Presidência dinamarquesa. Como exemplo do meu otimismo aponto os projetos que envolvem a utilização do CRISPR que tenho estado a propôr, em colaboração com o COTArroz (Centro Operativo e Tecnológico do Arroz), no sentido de fazer algum tipo de melhoramento. As nossas propostas mais fortes até agora estão relacionadas com a floração (queremos encurtar o tempo de floração) e com o aroma (queremos desenvolver algumas variedades com fragrância – o arroz Thai e o Basmati não são produzidos em Portugal, é importado).
Existem áreas específicas da sua investigação que dependem de avanços tecnológicos ou de novas descobertas científicas para alcançar os seus objetivos?
Não identifico nenhuma área em particular, no entanto, todos os avanços tecnológicos são sempre uma mais valia para a investigação que fazemos. A tecnologia permite fazer coisas diferentes e de uma forma mais rápida, como é o caso do CRISPR. Esta ferramenta de edição genética não só nos permite fazer coisas que não conseguíamos fazer como também torna possível fazermos mais rapidamente coisas que já fazíamos.
Portanto, sem o CRISPR-Cas9 não poderia desenvolver o trabalho que está a fazer e alcançar os mesmos resultados.
Sim, alguns trabalhos não conseguiria mesmo fazer e outros seriam tão demorados que provavelmente não me lançaria neles. Por exemplo, temos uma grande coleção de mutantes para genes relacionados com a resposta à luz. Esta coleção permite-nos ter plantas que não têm este ou aquele gene e estudar a função desses genes, perceber de que modo é que esses genes são prejudiciais ou alteram o desenvolvimento da planta. Sem o CRISPR seria tão mais complicado e moroso fazer isso que se calhar não avançaríamos com esse projeto.
Porque é que esta tecnologia é tão importante? Porque é que os agricultores europeus deviam ter acesso a sementes desenvolvidas com tecnologias de edição genética que permitem editar o genoma de plantas?
É importante porque permite fazer alterações no genoma da planta de modo a melhorar algumas características agronómicas ou organoleticas, de um modo rápido e eficiente, evitando o melhoramento tradicional, muito mais moroso. Com o CRISPR, introduzimos inicialmente um transgéne na planta que, depois, é segregado e ficamos com uma planta apenas editada (com uma edição precisa, ou seja, sabemos o sítio onde e que edição foi feita). Este tipo de edição é impossível de identificar, se não se souber que aconteceu, pois este tipo de modificação no genoma podia ter ocorrido naturalmente.
Nélson Saibo
Investigador Principal no ITQB NOVA, em Oeiras, dirige o Laboratório de Regulação da Expressão Génica em Plantas. Doutorado em Biotecnologia pela Universidade de Ghent, na Bélgica (em 2003), tem mais de 25 anos de experiência em biologia molecular de plantas. O foco do seu trabalho é compreender como as plantas respondem a estímulos ambientais, como a luz, temperatura, salinidade e água. O laboratório que lidera utiliza uma abordagem integrada para estudar os mecanismos moleculares que regulam as respostas das plantas aos fatores ambientais, nomeadamente ao nível do seu desenvolvimento, o que inclui a caracterização de fatores de transcrição e outros reguladores que desempenham papéis cruciais no crescimento e adaptação das plantas ao ambiente. Além disso, o seu trabalho também explora o uso de plantas modelo e culturas agrícolas para melhorar a eficiência fotossintética, com o objetivo de contribuir para a melhoria das culturas agrícolas em condições adversas.
Esta entrevista foi realizada pelo CiB e publicada na edição de maio da revista Vida Rural.