No Laboratório de Regulação da Expressão Génica em Plantas, no ITQB NOVA, o investigador Nélson Saibo e a sua equipa estão a utilizar a ferramenta de edição genética CRISPR-Cas9 para desenvolver investigação inovadora em arroz e tabaco. No caso do arroz, o objetivo é melhorar a sua resistência a condições ambientais adversas como secura, salinidade e temperaturas extremas – situações cada vez mais frequentes devido às alterações climáticas. No caso do tabaco, estão a estudar variantes da enzima Rubisco provenientes de outras plantas para melhorar a eficiência fotossintética e a tolerância da planta à secura e salinidade.
Entrevista: Margarida Paredes / CiB-Centro de Informação de Biotecnologia
Fotografia e vídeo: Orlando Almeida
Trabalha com arroz e utiliza a tecnologia CRISPR-Cas9. Que objetivos pretende atingir com a aplicação desta ferramenta nas plantas de arroz?
No caso do arroz, neste momento há dois projetos europeus principais (mais ativos) nos quais estamos envolvidos. Um é um projeto colaborativo, chamado Photoboost (https://www.photoboost.org/) que termina no fim deste ano e visa aumentar a eficiência fotossintética do arroz através da transformação com diferentes genes envolvidos na fotossíntese (transformação convencional). O outro chama-se CRISPIT (https://www.fc.up.pt/crispit/), é um projeto Marie Curie Staff Exchange coordenado pela Universidade do Porto. Neste caso, o objetivo é, utilizando a tecnologia CRISPR, criar variedades de arroz mais tolerantes às temperaturas elevadas na altura da floração. Estamos também a trabalhar num projeto em foto-biologia, que tem como objetivo estudar o efeito da luz no desenvolvimento do arroz, nomeadamente nas fases iniciais da germinação e no tempo de floração. E outro projeto que envolve o estudo da regulação do metabolismo / fotossíntese C4, com o objetivo final de implementar este metabolismo em plantas C3, como o arroz.
O objetivo final é sempre a melhoria da produtividade?
Sim, o objetivo é sempre esse, quer seja em condições ótimas, quer seja em condições adversas (de stress). Esse é sempre o objetivo do nosso trabalho, queremos obter conhecimento que mais tarde possa ser utilizado para melhorar a cultura do arroz, para melhorar a sua produtividade em diferentes aspetos. Não só como resposta a situações de stress – em Portugal temos o problema do frio, da salinidade e da falta de água – , mas também em condições ótimas. Por exemplo, um dos problemas que tempos em Portugal está relacionado com a altura em que o arroz vai florir. Um dos estudos que temos é nesse sentido. Fizemos uma publicação há dois anos na qual identificamos o mecanismo em arroz que regula o tempo de floração. Portanto, sabendo qual é o mecanismo de regulação da floração, nós conseguimos depois ajustar, nas diferentes variedades, o tempo de floração (mais tardio ou mais cedo, dependendo do que é mais favorável para os produtores).
Que desafios específicos enfrenta ao tentar melhorar a resistência das plantas de arroz às alterações climáticas?
Há dois desafios principais. Um deles é conseguir aplicar no campo o que fazemos no laboratório. Enquanto no laboratório o ambiente em que as plantas se desenvolvem é controlado (isto é, dificilmente combinamos os stresses – ou estudamos a salinidade, ou estudamos a resposta da planta ao frio, ou a resposta ao calor, ou a resposta à secura), no campo as plantas estão expostas a vários stresses abióticos e bióticos ao mesmo tempo. Isso faz com que, muitas vezes, os resultados que temos em laboratório não são observados no campo. Portanto, um dos nossos desafios é conseguir que os testes no campo reflitam aquilo que fizemos em laboratório, mas não é fácil. O que temos que mudar não é aquilo que fazemos no campo mas sim o que fazemos no laboratório, eventualmente tentar o mais possível reproduzir no laboratório as condições a que as plantas estão expostas no campo. Neste momento, esse é o principal desafio para mim.
Também trabalha com a planta de tabaco para estudar a enzima Rubisco. O objetivo é desenvolver tolerância à secura e salinidade em plantas cultivadas. De que forma é que isto acontece?
Em tabaco temos dois trabalhos que estão a decorrer em paralelo. Num identificámos três aminoácidos que poderiam estar relacionados com essa característica, essa resposta da planta, uma resposta mais adequada ou menos adequada da planta a condições adversas, neste caso de secura e de salinidade. Portanto, identificámos esses aminoácidos e fizemos modificações nos mesmos para estudar até que ponto é que as plantas, com aquelas modificações, se tornavam mais ou menos tolerantes aos stresses ambientais. Isso vai permitirá que esse conhecimento possa ser traduzido para outras plantas com mais interesse económico, nomeadamente cereais como o arroz, trigo e milho. Nós estamos a fazer isto em tabaco por causa da facilidade que há em fazer essa trasformação noutra planta. Aliás, já temos alguns resultados interessantes que depois poderão ser traduzidos para outras plantas.
Outro trabalho, com o tabaco também, consistiu em produzir uma ferramenta que permita a outros investigadores estudar a rubisco. O que se sabe é que rubiscos de diferentes espécies tem diferentes características e o que se faz muitas vezes é introduzir uma rubisco de girassol (que tem algumas características interessantes em termos de eficiência fotossintética) numa planta de tabaco para ver se funciona melhor ou não em relação à rubisco endógena. Mas aí o que vamos ter é uma mistura – a rusbisco de tabaco com a de girassol. O que quisemos fazer, e já conseguimos, foi eliminar a rubisco de tabaco para conseguir introduzir uma de girassol ou de outra planta ppara a estudar, tendo apenas aquela e não uma mistura. Portanto, o que fizemos basicamente foi, através da tecnologia CRISPR, eliminar as rubiscos no tabaco. Ficamos então com uma plantinha que basicamente não tem cloroplastos, não faz fotossíntese, é completamente branca e só cresce se lhe fornecermos açucar (o açucar que era suposto ela produzir através da fotossíntese se tivesse a rubisco).
Estuda o arroz e o tabaco porquê? Pela sua importância económica?
No caso do arroz essa foi a razão principal, sim. Trata-se de uma planta com um grande interesse económico a nível nacional (Portugal é o país que consome mais arroz per capita – 17 kg por pessoa por ano) e mundial (é a base alimentar de dois terços da população mundial, soobretudo da população mais pobre). Outro dos motivos que me levou a estudar o arroz é porque havia alguns problemas na cultura do arroz, nomeadamente o frio. Em Portugal é cultivado entre os meses de maio e setembro, mas mais a norte as noites permanecem frias e isso afeta a produtividade do arroz. O arroz é uma plantas muito sensível ao frio.
Que critérios utilizam para selecionar os genes a editar com a tecnologia CRISPR-Cas9?
Depende daquilo que estamos a fazer. Acho que posso agrupar dois grandes critérios. Um deles é se queremos fazer um estudo funcional de genes temos de inativar ou fazer o chamado knockout do gene para percebermos de que modo ele faz falta na planta). Outro critério é dependendo da maneira como o gene é regulado, tentamos identificar um gene cuja sua eliminação pode ser benéfica. Estes são fundamentalmente os critérios que usamos para selecionar genes que vamos editar com CRISPR. Em Portugal, esta tecnologia tem sido maioritariamente utilizada para eliminar genes, porque é o que é mais fácil; tem sido pouco utizada para fazer edição fina (alterar um nucletido ou um aminoácido), porque isso inicialmente exigia que houvesse recombinação homóloga – a recombinação homóloga em plantas é possível, mas tem uma eficiência muito baixa. Hoje em dia obtemos essa eficiência com a tecnologia Prime editing, que é ligeiramente diferente, permite-nos fazer a tal alteração fina dos genes (o Prime editing faz parte do CRISPR, exige na mesma ter uma nuclease.
Por que razão optou pela tecnologia CRISPR-Cas9 e não por outras ferramentas de edição genética?
O CRISPR tem evoluído muito nos últimos anos. É muito eficiente e muito flexível. As pessoas ouvem falar mais no CRISPR-Cas9, mas existem muitos mais Cas, existem diferentes nucleases que nos dão uma flexibilidade muito maior porque têm características diferentes, têm algumas particularidades que nos permitem fazer coisas diferentes e com uma precisão diferente também.
Existem riscos associadas ao uso de CRISPR-Cas9 em plantas?
O único risco que consigo identificar é aquilo a que chamaos offtargets, ou seja, os alvos não específicos. O CRISPR funciona com o desenho de um oligonucleotídeo que, com uma sequência de DNA ou de RNA neste caso, vai permitir identificar o sítio no genoma que queremos editar. Se essa sequência de RNA não for tão específica como gostaríamos, pode identificar essa sequência ou pode identificar outra, indo provocar uma edição noutro sítio no genoma. O que temos de fazer é tentar desenhar essa sequência o mais especificamente possível (as ferramentas que existem hoje em dia permitem fazer isso e permitem prever que alvos não desejáveis poderão acontecer e em que percentagem; o que nós fazemos depois é sequenciar esses alvos. No meu laboratório já editamos mais de uma centena de genes e nunca identificamos nenhum alvo não desejado. Diria que o risco é muito pequeno uma vez que, mesmo que aconteça, a tecnologia permite editá-lo.
Qual é o resultado mais interessante até agora da investigação que tem desenvolvido no arroz?
Talvez o resultado mais interessante, que só foi possível graças à utilização da tecnologia CRISPR, é termos conseguido perceber de que modo é que o fotoperíodo regula o tempo de floração na planta do arroz.
Por que é que a forma como o fotoperíodo regula a floração do arroz é importante para aumentar a produtividade?
O fotoperído é o tempo de horas de luz. Sabemos que um dos problemas da plantação do arroz em Portugal está relacionado com os picos de calor que ocorrem nas últimas duas semanas de arroz, altura em que o arroz está a florir e em que está a acontecer a fecundação. Se em vez de 90 dias conseguíssemos encurtar o tempo de floração para 60 dias, poderíamos evitar o período de maior pico de calor. Isso permitiria aumentar a produtividade. O conhecimento destes mecanismos poderá permitir-nos cultivar em Portugal variedades de arroz que hoje em dia não conseguimos cultivar porque não estão adaptadas ao nosso fotoperíodo.
A União Europeia quer criar uma regulamentação específica para as Novas Técnicas Genómicas (NTG). Tem esperança que as suas descobertas possam ser aplicadas na agricultura em larga escala e no combate às mudanças climáticas ou teme que não passarão de experiências no laboratório?
Tenho muita esperança que dentro de pouco tempo surja uma regulamentação das NTG favorável a sua utilização no campo. Se não for durante a Presidência polaca [do Conselho da UE], espero que seja na Presidência dinamarquesa. Como exemplo do meu otimismo aponto os projetos que envolvem a utilização do CRISPR que tenho estado a propôr, em colaboração com o COTArroz (Centro Operativo e Tecnológico do Arroz), no sentido de fazer algum tipo de melhoramento. As minhas propostas mais ‘sérias’ até agora estão relacionadas com a floração (queremos encurtar o tempo de floração) e com o aroma (queremos desenvolver algumas variedades com fragrância – o arroz Thai e o Basmati não são produzidos em Portugal, é importado).
Existem áreas específicas da sua investigação que dependem de avanços tecnológicos ou de novas descobertas científicas para alcançar os seus objetivos?
Não identifico nenhuma área em particular, no entanto, todos os avanços tecnológicos são sempre uma mais valia para a investigação que fazemos. A tecnologia permite fazer coisas diferentes e de uma forma mais rápida, como é o caso do CRISPR. Esta ferramenta de edição genética não só nos permite fazer coisas que não conseguíamos fazer como também torna possível fazermos mais rapidamente coisas que já fazíamos.
Portanto, sem o CRISPR-Cas9 não poderia desenvolver o trabalho que está a fazer e alcançar os mesmos resultados.
Sim, alguns trabalhos não conseguiria mesmo fazer e outros seriam tão demorados que provavelmente não me lançaria neles. Por exemplo, temos uma grande coleção de mutantes para genes relacionados com a resposta à luz. Esta coleção permite-nos ter plantas que não têm este ou aquele gene e estudar a função desses genes, perceber de que modo é que esses genes são prejudiciais ou alteram o desenvolvimento da planta. Sem o CRISPR seria tão mais complicado e moroso fazer isso que se calhar não avançaríamos com esse projeto.
Porquê que esta tecnologia é tão importante? Porque é que os agricultores europeus deviam ter acesso a sementes desenvolvidas com tecnologias de edição genética que permitem editar o genoma de plantas?
É importante porque permite fazer alterações no DNA da planta (de modo a melhorar algumas características) que poderiam acontecer naturalmente. Na verdade, naturalmente podem acontecer muito mais mutações na planta do que com o CRISPR. Com o CRISPR, fazemos inicialmente um transgénico que, depois, é segregado e nós ficamos com uma planta apenas editada (com uma edição precisa, ou seja, sabemos o sítio onde a edição foi feita). E é impossível identificar essa edição, essa modificação como tendo sido feita pelo homem ou tendo ocorrido naturalmente.
Nélson Saibo
Investigador Principal no ITQB NOVA, em Oeiras, dirige o Laboratório de Regulação da Expressão Génica em Plantas. Doutorado em Biotecnologia pela Universidade de Ghent, na Bélgica (em 2003), tem mais de 15 anos de experiência em biologia molecular de plantas. O foco do seu trabalho é compreender como as plantas respondem a estímulos ambientais, como frio, salinidade elevada e seca. O laboratório que lidera utiliza uma abordagem integrada para estudar os mecanismos moleculares que regulam as respostas das plantas ao stress ambiental e ao desenvolvimento, o que inclui a identificação de fatores de transcrição, elementos reguladores e modificações epigenéticas que desempenham papéis cruciais na adaptação das plantas. Além disso, o seu trabalho também explora o uso de plantas modelo e culturas agrícolas para melhorar a tolerância ao stress abiótico e a eficiência fotossintética, com o objetivo de contribuir para a melhoria das culturas agrícolas em condições adversas.
* Esta entrevista foi feita pelo CiB-Centro de Informação de Biotecnologia e publicada na edição de abril da revista Vida Rural.